蛋白降解是什么？在医学领域如何应用？

蛋白降解是什么？在医学领域如何应用？

靶向蛋白质降解 (targeted protein degradation，TPD)是药物发现中具有革命性意义的策略。与传统的直接靶向蛋白（酶）不同，靶向蛋白降解是通过调节宿主蛋白降解系统来发挥治疗效果的。因此，TPD候选者对高亲和力配体结合的依赖性降低，并且可以募集靶点参与多个蛋白降解过程，从而降低耐药性的产生，更容易发现具有低纳摩尔效力的候选药物。

在真核系统中，泛素-蛋白酶体系统 (UPS) 在细胞质和细胞核中维持蛋白质质量控​​制，使其成为诱导细胞内蛋白质降解的有吸引力的系统。该系统通过复杂的信号通路进行调节，需要用泛素信号分子标记错误折叠的蛋白质。不同大小和构象的泛素链的组装能够识别和参与所需的降解机制。多泛素化是泛素激活、-耦合和-连接的连续过程，每个过程都由不同的E1、E2、和E3酶（图1）。

类似于最近发现的IMiD的作用模式，调节CRBN E3 泛素连接酶的底物特异性，吡嗪酰胺被偶然发现可通过降解途径发挥抗菌作用。吡嗪酰胺是用于抗结核病治疗的一种药物，该药是一种前药，需要通过吡嗪酰胺酶 (PZase) 初步转化为其活性形式吡嗪酸 (POA)（图2）

最近的研究表明，POA诱导酪蛋白水解蛋白酶ClpP1P2降解PanD。有证据表明，POA与PanD的结合诱导了一个主要的构象变化，暴露了PanD中原本隐藏的C 端降解子，表明它被ClpP1P2降解。这一机制的发现为劫持原核酪蛋白水解蛋白酶家族来降解非天然底物的提供了可能性，是对新型细菌蛋白质降解剂的有力支持。

围绕TPD应用设计下一代抗菌剂，潜在的策略可能包括（i）在细胞内细菌聚集体表面表达的粘附生物膜成分可作为蛋白酶体依赖性降解的靶标，以去除生物膜菌落（抗生物膜降解剂）；（ii）毒力效应子（例如VacA）由细菌分泌以逃避宿主体内的免疫反应（例如自噬-溶酶体途径），并代表通过蛋白酶体（PROTAC）降解的有吸引力的细胞内目标：（iii）毒力效应子阻止自噬体成熟，抑制溶酶体融合并使细菌菌落在分离的液泡中增殖；（iv）细菌膜突出结构（例如分泌系统或粘附蛋白）或分泌毒素（例如 HtrA）的内化导致溶酶体依赖性降解（LYTAC）；（v) ClpP 可能被劫持以降解细胞质蛋白;（vi）HtrA 可能被劫持以降解周质或外膜蛋白（图3）。

2.1 细胞内细菌感染：采用 PROTAC 方法

通过逃避自噬-溶酶体途径来规避宿主免疫反应以及生物膜对传统小分子药物杀伤的敏感性减弱可能会导致慢性或复发性细胞内感染治疗的困难。研究表明，细菌会劫持自噬-溶酶体途径作为安全增殖或渗入宿主细胞细胞质的手段。多数情况下，细菌分泌毒力效应物（virulence effectors）和毒素以减弱宿主免疫反应，促进将细菌包裹在营养丰富的未成熟自噬体中，这些自噬体缺乏溶酶体融合后破坏病原体所需的水解酶。例如，幽门螺杆菌分泌空泡毒素 A (VacA)，诱导细菌自噬进入自噬体，同时抑制自噬体成熟，创造一个安全的环境，直到细菌分泌成孔毒素促进它们从吞噬体中逃脱（自噬成熟的停滞如图3，（iii）所示）。许多细菌利用类似的分泌蛋白来利用自噬-溶酶体途径并依靠这种机制建立细胞内感染。设计基于泛素依赖性PROTAC型嵌合抗菌剂将会补充目前以隔离细菌外毒素的为目标的抗菌策略，为恢复宿主针对细胞内感染的天然防御系统提供了一条途径（图3，(ii))。

细菌用来使其细胞内存活的另一种策略是形成生物膜样细菌聚集体。厚厚的聚合物生物膜基质为细菌在宿主内茁壮成长创造了一个孤立的环境，抑制抗生素作用和宿主免疫反应，捕获营养物质，并通过粘附蛋白将细菌菌落固定在宿主细胞表面。因此，靶向蛋白质生物膜成分的降解剂可能会破坏或清除细胞内生物膜菌落，从而恢复细菌对抗生素的敏感性（图3，（i））。

2.2 细胞外细菌感染：采用 LYTAC方法

在细菌造成细胞内感染之前，采用LYTAC概念来设计针对细胞外毒力因子或细菌膜结合蛋白的抗菌降解剂可以作为基于PROTAC方法的补充，该方法将具有早期中和细菌致病性的潜力（图 3，（iv））

LYTAC策略的另一个潜在应用可能是针对膜结合和/或突出的细菌蛋白质，例如分泌系统或细菌菌毛/菌毛。由于它们在毒力分泌和宿主粘附系统中的重要作用，消除这些系统将严重阻碍细菌的致病性。宿主细胞表面受体和细菌膜结合蛋白的同时结合是否会因其不同的位置而受到阻碍尚不清楚。由于三元复合物的形成驱动蛋白质降解，无法在不同的膜成分之间形成三元复合物可能会抑制溶酶体依赖性降解。

抗菌疗法需要利用细菌中具有蛋白降解功能的成分，而非劫持哺乳动物的蛋白质降解途径。然而，细菌蛋白酶体仅在放线菌中表达，例如结核分枝杆菌 (M.tb)。与泛素化不同，原核生物中，底物在赖氨酸侧链上被泛素样蛋白 (ubiquitin-like protein，Pup) 标记为降解，导致底物Pupylation。

尽管存在原核蛋白酶体，细菌中的蛋白质周转由细胞内蛋白酶的保守家族处理，即依赖ATP的AAA+蛋白酶：Clp、Lon、FtsH、HsIUV、Tsp和不依赖ATP的高温需要（high temperature requirement, HtrA ) 蛋白酶。与真核系统中的以多泛素为信号传递到26蛋白酶体不同，原核生物蛋白质序列元件被衔接蛋白（adaptor proteins）或蛋白酶本身识别。值得一提的是，这些蛋白酶也存在于真核生物的线粒体和叶绿体中。

由于细菌细胞内蛋白酶通常具有低底物特异性，它们形成多聚体室状构象，以避免通过活性位点的区室化进行非选择性蛋白水解。天然蛋白水解酶的活性位点通常处于未对准的状态，底物无法接近，直到衔接蛋白与外部的变构识别域相互作用，使亲本蛋白酶能够从封闭、无活性状态转变为开放、有活性的构象，以允许底物进入降解室。通过AAA+解折叠酶伙伴(ATPases)以及控制ATPases活性的抗适应蛋白（antiadaptor proteins）进一步控制底物特异性。

C-和 N-降解子（degron）对细菌蛋白质的标记代表了原核蛋白质稳态的微调机制。由于 mRNA受损，细菌核糖体上的翻译停滞导致反式翻译。与 C-降解子相比，N-降解子途径依赖于符合N-end规则的N端残基的去稳定作用。除了 N-和 C-降解子标签之外，枯草芽孢杆菌中蛋白质的精氨酸磷酸化（pArg）通过ClpCP蛋白酶影响降解作用也已经被观察到。

抗生素药物的发现传统上侧重于抑制必需蛋白质靶标作为杀死细菌的手段，而激活蛋白水解机制以实现相同结果的概念是一个新兴概念。尽管尚未用于治疗细菌感染，但自从1995年批准沙奎那韦用于HIV/AIDs的治疗以来，蛋白酶抑制剂已在临床上用于多种疾病适应症。

与细菌蛋白酶体结合的来制造广谱抗菌降解剂的想法，（类似于E3连接酶参与的通过多泛素化驱动的真核生物TPD），受到两点限制，一是细菌蛋白酶体仅在放线菌目和硝化螺旋菌目中，二是实际的必要性。

设计第一代抗菌蛋白降解剂的一种方法是设计双功能嵌合体，其中包含降解标签和用于细菌POI（protein of interest）靶标接合的合适配体，前提是有一种方法可以将POI传递给合适的蛋白酶。对于不存在配体的新型POI靶标，需要进行筛选活动以识别合适的结合剂。对于已知配体的POI（例如，抗生素、变构结合剂），由于高效蛋白降解受稳定三元复合物形成的严重影响，因此不太强调识别或优化高亲和力结合剂。如何选择合适的细菌蛋白酶进行参与以及如何有效地将POI 与推定的双功能降解剂结合仍然存在问题。靶标选择将是告知这一选择的主要决定因素，因为上述细菌蛋白酶的不同细胞位置将决定它们与细菌蛋白质接触的能力。

ClpP的保守特性和相当大的蛋白水解活性使其成为双功能抗生素蛋白降解剂的理想起点，具有降解革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌病原体的多种必需细胞质蛋白的能力。相比之下，Lon和FtsH已被确定为较弱的蛋白水解机器，因此利用这些蛋白酶可能不是实现功能性、结构化 POI 的有效降解的最佳选择。HtrA蛋白酶的周质位置及其作为不依赖 ATP 的蛋白酶的独特身份使其成为另一个选择。最近发现的用于ClpP 和 HtrA 的新型细菌蛋白酶激活剂为将这些蛋白酶与已知配体结合提供了一个理想的起点（图4）

TPD代表了一个充满活力的药物发现创新领域，第一批治疗性降解剂候选药物的临床结果无疑将塑造未来几代降解剂。现在是回顾这些丰富的知识以开发原核蛋白质降解剂的激动人心的时刻。通过早期验证研究推进潜在细菌蛋白质降解剂的工作流程的图形表示（图5）。

靶向蛋白质降解代表了一种革命性的治疗策略，有可能解决当代药物设计的局限性。在抗菌素耐药性时代，靶向降解策略是抗生素武器库的一个补充，具有潜在优势，例如提高特异性和对耐药突变的耐受性。抗菌TPD技术的最终目标将是开发能够使用原核生物或真核生物降解机制引起必需细菌蛋白质有效、特异性降解的下一代试剂。期望抗菌蛋白降解剂的取得进一步的发展。

参考文献

Powell, M., Blaskovich, M.A. and Hansford, K.A. Targeted Protein Degradation: The New Frontier of Antimicrobial Discovery? ACS Infectious Diseases. 2021